Nature Communications volume 14, número do artigo: 4082 (2023) Citar este artigo
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Três tipos de modificações de metila no DNA foram detectados em genomas bacterianos, e estudos mecanísticos demonstraram papéis para a metilação do DNA em funções fisiológicas que vão desde a defesa do fago até o controle transcricional da virulência e interações patógeno-hospedeiro. Apesar da onipresença das metiltransferases e da imensa variedade de possíveis padrões de metilação, a diversidade epigenômica permanece inexplorada para a maioria das espécies bacterianas. Os membros do grupo Bacteroides fragilis (BFG) residem no trato gastrointestinal humano como atores-chave em comunidades simbióticas, mas também podem estabelecer infecções anaeróbicas que são cada vez mais resistentes a múltiplos medicamentos. Neste trabalho, utilizamos tecnologias de sequenciamento de leitura longa para realizar análises pangenômicas (n = 383) e panepigenômicas (n = 268) de isolados clínicos de BFG cultivados a partir de infecções observadas no NIH Clinical Center ao longo de quatro décadas. Nossa análise revela que espécies únicas de BFG abrigam centenas de motivos de metilação de DNA, com a maioria das combinações de motivos individuais ocorrendo exclusivamente em isolados únicos, implicando imensa diversidade de metilação não amostrada nos epigenomas de BFG. A mineração de genomas de BFG identificou mais de 6.000 genes de metiltransferase, aproximadamente 1.000 dos quais estavam associados a profagos intactos. A análise de rede revelou um fluxo gênico substancial entre genomas de fagos díspares, implicando um papel para a troca genética entre fagos BFG como uma das principais fontes que impulsionam a diversidade do epigenoma BFG.
A metilação do DNA genômico foi detectada em todos os três domínios da vida celular, bem como em vírus1,2,3. Os genomas eucarióticos exibem metilação dinâmica da citosina na posição C5 (5mC) dentro de certos contextos CpG (5'-CG-3'), e a regulação desta metilação CpG em locais específicos afeta a transcrição4, a dinâmica de reparo do genoma e a compactação do genoma5. Em contraste, as bactérias apresentam metilação do DNA específica do motivo (por exemplo, 5'-CC-6mA-TGG-3'), onde quase todas as ocorrências de um determinado motivo podem ser metiladas6. Semelhante aos genomas eucarióticos, as modificações de 5mC são comuns; no entanto, os genomas bacterianos apresentam metilação adicional na posição N4 das citosinas (4mC) e, mais comumente, na posição N6 das adeninas (6mA)6. A metilação do DNA bacteriano é conduzida por DNA metiltransferases, algumas das quais parecem estar presentes e ativas em todas as cepas de uma determinada espécie (por exemplo, Dam, que modifica GATC em Escherichia coli), enquanto outras DNA metiltransferases e os genes que as codificam são transitoriamente ganhos e perdidos ao longo do tempo e não são essenciais para a viabilidade da cultura7. Classicamente, a metilação do DNA bacteriano tem sido entendida principalmente como um subproduto da defesa anti-fago baseada em sistemas de modificação de restrição8. No entanto, outras consequências fisiológicas da manutenção do ADN metilado, muitas vezes em milhares de loci, tornaram-se agora claras. Estudos demonstraram papéis para a metilação do DNA bacteriano na regulação da atividade transcricional controlando fenótipos de virulência9,10,11 e outros programas fisiológicos12,13, estabilidade do genoma14,15 e afetando a frequência de mutação dentro de motivos metilados16,17, semelhante às observações em sistemas eucarióticos.
As bactérias do grupo Bacteroides fragilis (BFG) representam mais de uma dúzia de espécies dos gêneros Bacteroides, Parabacteroides e recentemente introduzidos Phocaeicola . Esses abundantes simbiontes podem ser facilmente encontrados vivendo anaerobicamente no trato gastrointestinal humano e têm sido implicados em muitas funções metabólicas e imunológicas importantes19,20,21. Estão também entre as bactérias mais comumente recuperadas de infecções anaeróbias extraintestinais e são cada vez mais resistentes a muitos antibióticos, incluindo cefalosporinas e carbapenêmicos22,23. Seu amplo alcance fenotípico é possibilitado em parte pela variação de fase, uma série de loci de utilização de polissacarídeos e seu uso de promotores invertíveis .
5 kb each) could be detected in assemblies (Supplementary Fig. 1C). The numbers of identified rRNA operons per circular chromosome corresponded to the expected values for the species in almost all cases based on data derived from the Ribosomal RNA Database27./p>20,000 sampled genes within the dataset, implying that an immense number of additional gene families await discovery within the BFG. This pangenome openness is largely consistent with gut-derived Bacteroides metagenome assembled genomes32./p>3 kb in length encoding only accessory genes, Supplementary Data 3) were extracted from 414 genomes representing 13 species for which three or more genomes were available (378 genomes from this study and 36 genomes from NCBI)33. Comparison of each accessory region sequence with all others in this set demonstrated that >10% of such regions were shared between species, suggesting horizontal transfer (Fig. 2c). Each accessory region was probed for a variety of features, and it was found that phage, phage defense systems, DNA methyltransferases, conjugative machinery, episomes/plasmids, and antimicrobial resistance (AMR) genes were all more common in accessory regions detected in three or more species (Fig. 2c). For instance, accessory regions encoding the tetracycline resistance gene tet(Q) and/or a cassette with genes tet(X)1, tet(X)2, and the aminoglycoside modifying enzyme aadS were detected in 12 of 13 species analyzed (Fig. 2 and Supplementary Fig. 4), likely confirming a history of selective pressure from tetracycline and aminoglycoside compounds./p>95% average nucleotide identity (see Methods) (Supplementary Fig. 5A). The majority of circular contigs (550 out 575; 95.7%) had recognizable plasmid genes such as replicases or relaxases (see Methods), and a proportion of the remainder may represent replicative intermediates of transposons, but this was not analyzed further. Despite the ubiquity of both plasmids/episomes and AMR genes in the sequencing data, we found that most of these AMR genes were not located on plasmids/episomes (53 out of 1911 AMR genes were located within circular plasmid/episome contigs) among BFG species. The overwhelming majority (>97.2%) of AMR genes appeared to be located within chromosomes, and many were associated with integrative elements23. Many of the AMR genes encoded by plasmids/episomes also appeared associated with integration of integrative elements into plasmid backbones, consistent with possible shuttling of AMR genes between chromosomes and plasmids/episomes (Supplementary Fig. 5B)./p>90% of genomes in a species, ‘Shell’ was defined as presence in >10% and ≤90% genomes in a species, and ‘Cloud’ was defined as presence in <10% of genomes in a species./p>90% amino acid identity to previously identified DNA methyltransferases. Interestingly, in the course of our analysis, we observed that within each species, there is a positive correlation between genome size and number of putative DNA methyltransferases (Supplementary Fig. 6). BFG-632 is the longest genome in the entire collection, consistent with the greatest number of methyltransferases./p> = 95 and AF > = 85 were counted. Note that accessory region sequences can often consist of multiple mobile genetic elements or genomic islands in tandem, and no attempt was made to separate individual elements within these regions with the exception of bacteriophages./p>50 copies per chromosome), and in some cases these high copy number plasmids/episomes were represented in lower copy number in companion libraries sequenced on the same flow cell. We assessed that this was likely library cross-contamination and to reduce the likelihood of artifactual assignment of plasmids/episomes to the incorrect library, we excluded circular contigs with coverage that was either 80% of the coverage value of the bacterial chromosome or less or if the coverage was less than 30-fold on average across the sequence. This may have resulted in an underestimate of the true number of plasmids/episomes. Furthermore, the Flye assembler occasionally artifactually assembles sequences as concatemers of two or more tandem copies. Each circular sequence was aligned to itself with BLASTN, and, if the total length of the alignment was greater than 140% of the total length of the sequence, the episome was trimmed down to one unit length to eliminate potential artifactual tandem duplications. To determine if the filtered sequences had plasmid-associated genes, each sequence was run through MOBsuite75 followed by RPS-BLAST against the CDD database76 with flags “ -evalue 1e-2 -seg yes”. Hits were then cross-checked against a list of models related to plasmid replicases, relaxases, conjugative machinery, integrases, and transposes (Supplementary Data 14). Also, Abricate was run as described above on each sequence. Plasmids/episomes were clustered into approximate operational taxonomic units (OTUs) using anicalc and aniclust from CheckV with flags “--min_ani 95 --min_tcov 85” (minimum ANI = 95%, minimum AF = 85%). The network graph was visualized in Cytoscape77./p>10 Tb). Requests for materials associated this work require a standard NIH Material Transfer Agreement with the NIH and U.S. Government. Requests for materials should be addressed to John Dekker at [email protected]./p>
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