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Scientific Reports volume 13, Artigo número: 13017 (2023) Citar este artigo

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Detalhes das métricas

A identificação das espécies é necessária para evitar a introdução de pragas de plantas exóticas através do comércio global. Muitas destas pragas são pouco estudadas e carecem de dados de sequências de ADN disponíveis ao público, nos quais se possam basear métodos rápidos de identificação molecular. Uma dessas linhagens é o gênero Chrysodeixis, que inclui três espécies de potencial preocupação para as iniciativas comerciais dos Estados Unidos: C. includens, C. chalcites e C. eriosoma. Aqui descrevemos um método para gerar perfis robustos de rDNA 45S usando sequenciamento de leitura longa, a fim de esclarecer relações evolutivas e desenvolver uma técnica de identificação de PCR em tempo real. Tal ferramenta de identificação será útil na diferenciação rápida entre espécies de Chrysodeixis de preocupação quarentenária, onde os métodos tradicionais de identificação morfológica são insuficientes. Métodos moleculares como este reduzem muito o tempo gasto na identificação de cada amostra, permitem a detecção de eDNA, aumentam enormemente o rendimento e aumentam a probabilidade de detecção. Os métodos aqui apresentados serão geralmente adaptáveis ​​a qualquer táxon de lepidópteros pouco estudado que necessite de um ensaio de diagnóstico molecular e, com ajuste ou teste dos primers, poderá ser aplicado a qualquer grupo para o qual o desenvolvimento de perfis de rDNA em um ambiente de bancada seria útil.

O diagnóstico de espécies é cada vez mais importante num mundo globalizado onde a translocação de espécies mediada pelo homem (especialmente plantas e insectos) está a ocorrer a uma taxa mais elevada do que nunca1,2. Com o aumento do movimento de pessoas e o transporte global de produtos agrícolas, incluindo culturas alimentares, flores cortadas e material de embalagem de madeira, a capacidade de detectar e identificar rapidamente quaisquer insectos associados é fundamental para limitar a introdução e o estabelecimento de espécies de pragas invasoras3,4. Nos Estados Unidos, as inspeções de cargas e mercadorias nos portos de entrada e as pesquisas nacionais de pragas exóticas são utilizadas para rastrear a presença de pragas de insetos. A identificação destes espécimes pode ser difícil e muitas vezes depende de um registo preciso do hospedeiro onde o organismo foi encontrado e da origem do envio, ambos os quais podem ser complicados devido ao transbordo através de múltiplos locais5. Em muitos casos, as pragas interceptadas só podem ser identificadas na família, subfamília ou gênero. Isto é especialmente verdadeiro para os lepidópteros, que são quase exclusivamente interceptados na fase larval.

A identificação de insetos capturados durante pesquisas domésticas também é um desafio porque a atração cruzada por iscas de feromônios pode resultar na captura de dezenas ou centenas de não-alvos semelhantes em uma única armadilha. A identificação rápida de alvos potenciais é desejável para detectar espécies invasoras antes do estabelecimento (ou seja, a fase de latência6), mas isso muitas vezes requer a dissecção de cada amostra ou uma abordagem molecular, como o código de barras do DNA da citocromo c oxidase 1 (CO1)7. Ambas as abordagens são demoradas e podem não ser confiáveis ​​para espécies anteriormente não descritas, mal caracterizadas ou que não possuem dados de sequência disponíveis publicamente. Para melhorar as chances de detecção de espécies invasoras, foram desenvolvidos ensaios moleculares rápidos ou de alto rendimento para algumas espécies de pragas de insetos comumente interceptadas e potencialmente invasivas (por exemplo,8,9,10,11). As técnicas de identificação molecular de alto rendimento não apenas aumentam a probabilidade de detecção, mas também reduzem drasticamente o tempo e o custo necessários para completar as identificações, especialmente no caso de ensaios multiplexados12,13. Algumas espécies que apresentam alto potencial de invasão também são pouco estudadas e carecem de informações básicas, como localização filogenética e descrição de espécies irmãs, variação filogeográfica dentro da espécie ou dados de sequência disponíveis publicamente .

Embora um grande banco de dados de sequências de CO1 esteja disponível para muitas espécies (ou seja, BOLD15, GenBank16), esta região pode ser pouco adequada para o desenvolvimento de técnicas baseadas em sequências de DNA, como PCR em tempo real, devido ao alto conteúdo de AT, baixa variação interespécies e /ou alta variação intraespécie resultante de rápida evolução e deriva genética17. Nestas situações, a identificação de espécies pode muitas vezes ser realizada de forma confiável utilizando regiões de RNA ribossômico 45S (rRNA). Entre os primeiros ácidos nucleicos a serem sequenciados, o rRNA 45S é altamente abundante no genoma e de comprimento relativamente curto . A unidade de rRNA é composta por repetições em tandem estruturalmente conservadas compostas por um espaçador transcrito externo (ETS), rRNA 18S, espaçador transcrito interno (ITS) 1, rRNA 5,8S, ITS2 e rRNA 28S19. Estas propriedades do rRNA, bem como a conservação da sequência nas regiões codificantes e as altas taxas de evolução nas regiões ITS não codificantes no DNA ribossômico subjacente (rDNA), levaram ao uso deste locus para estudos filogenéticos em toda a árvore de vida20,21. A partir desses estudos filogenéticos, grandes quantidades de dados de sequências de rDNA foram disponibilizadas publicamente, a partir dos quais os pesquisadores desenvolveram métodos para identificação rápida de espécies. Esses loci são ideais para tais ensaios moleculares porque as regiões ITS são relativamente conservadas dentro das espécies, altamente variáveis ​​entre espécies (com mutações pontuais e indels) e presentes em altos números de cópias no genoma. Isto os torna candidatos ideais para o desenvolvimento de ensaios de PCR baseados em sondas8,22,23 e permite a amplificação dessas sequências mesmo a partir de DNA degradado ou em amostras ambientais de alta complexidade24,25. Como as sequências codificadoras de rRNA 18S, 28S e 5.8S são altamente conservadas, o desenvolvimento de primers universais para amplificar toda essa região é possível, mesmo que nenhum dado de sequência de rDNA esteja disponível para a espécie em questão. No entanto, devido ao elevado número de cópias dentro de um único genoma, existem diferenças de nucleotídeos entre as cópias dentro de um indivíduo. Essas variações intraindividuais são consideradas ribotipos26,27, e tal variação ribotípica deve ser evitada ao desenvolver uma técnica confiável baseada em DNA para identificação de espécies, embora a caracterização da variação ribotípica raramente seja concluída. O uso de um método de sequenciamento de alto rendimento é, portanto, útil para caracterizar a diversidade ribotípica e para diferenciar entre variações fixas e transitórias que existem entre repetições.