Alto

Parasitas e Vetores volume 16, Número do artigo: 282 (2023) Citar este artigo

259 Acessos

1 Altmétrico

Detalhes das métricas

A leishmaniose é uma doença zoonótica endêmica na região do Mediterrâneo, onde a Leishmania infantum é o agente causador da infecção humana e canina. A caracterização deste parasita ao nível da subespécie pode ser útil em estudos epidemiológicos, para avaliar o curso clínico da doença (por exemplo, estirpes resistentes, formas viscerais e cutâneas de leishmaniose), bem como para identificar reservatórios de infecção. A eletroforese enzimática multilocus (MLEE), um método atualmente reconhecido como método de referência para caracterização e identificação de cepas de Leishmania, é complicada e demorada e requer parasitas cultivados. Essas desvantagens levaram ao desenvolvimento de outros métodos, como a tipagem de microssatélites multilocus (MLMT) e a tipagem de sequências multilocus (MLST), para tipagem de parasitas Leishmania; no entanto, estes métodos ainda não foram aplicados para uso rotineiro. Neste estudo, usamos primeiro o MLST para identificar polimorfismos informativos em genes de cópia única que codificam enzimas metabólicas, após o que desenvolvemos dois ensaios de genotipagem rápida baseados na análise de fusão de alta resolução (HRM) para explorar esses polimorfismos em parasitas L. infantum.

Um painel de sequenciamento personalizado visando 14 genes de limpeza foi projetado e a análise MLST foi realizada em nove cepas/isolados caninos e humanos de L. infantum. Dois ensaios quantitativos de PCR-HRM em tempo real foram projetados para analisar dois polimorfismos informativos nos genes da enzima málica (ME) e da glicose-6-fosfato isomerase (GPI) (390T/G e 1831A/G, respectivamente). Os dois ensaios foram aplicados a 73 amostras/isolados clínicos do centro/sul da Itália e da ilha de Pantelleria, e os resultados foram confirmados por sequenciamento de DNA em um subconjunto de amostras.

A análise MLST, juntamente com sequências disponíveis na base de dados Genbank, permitiu a identificação de dois polimorfismos informativos nos genes que codificam ME e GPI. A rápida triagem desses polimorfismos utilizando dois ensaios baseados em HRM em 73 amostras/isolados clínicos resultou na identificação de sete genótipos. No geral, o genótipo 1 (sequência tipo 390T/1831G) foi o mais representado (45,2%) na amostra geral e correlacionou-se com os zimodemas mais comuns de L. infantum (MON-1, MON-72). Curiosamente, na ilha de Pantelleria, o genótipo mais prevalente (70,6%) foi o genótipo 6 (sequência tipo 390T/1831A).

A aplicação de nossos ensaios de HRM em amostras clínicas nos permitiu identificar sete genótipos diferentes sem a necessidade de isolamento e cultivo de parasitas. Nós demonstramos que esses ensaios poderiam ser usados ​​como ferramentas rápidas, rotineiras e baratas para vigilância epidemiológica de L. infantum ou para identificação de novos reservatórios de infecção.

A leishmaniose é uma doença zoonótica endémica na bacia do Mediterrâneo, causada principalmente pela Leishmania infantum, agente etiológico da leishmaniose cutânea e visceral humana (LC e LV, respetivamente), bem como da leishmaniose canina (LCan). A caracterização de Leishmania é tradicionalmente realizada por eletroforese enzimática multilocus (MLEE), que atualmente ainda é considerada pela OMS como o método de referência para tipagem de parasitas [1]. O MLEE, desenvolvido no Centro de Leishmaniose de Montpellier (França) (sistema MON), baseia-se nas diferentes mobilidades eletroforéticas de 15 enzimas metabólicas: malato desidrogenase (MDH), enzima málica (ME), isocitrato desidrogenase (ICD), 6-fosfogluconato desidrogenase (PGD), glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), glutamato desidrogenase (GLUD), NADH diaforase (DIA), purina nucleosídeo fosforilase 1 (NP1), purina nucleosídeo fosforilase 2 (NP2), glutamato-oxaloacetato transaminases 1 e 2 (GOT1, GOT2), fosfoglucomutase (PGM), fumarato hidratase (FH), manose-fosfato isomerase (MPI) e glicose-6-fosfato isomerase (GPI) [2]. A comparação da mobilidade das isoenzimas com uma cepa de referência levou à identificação de > 300 zimodemas, todos referidos usando termos MON. Em relação ao L. infantum, foram identificados 45 zimodemas. A LV zoonótica e a LCan são causadas principalmente pelos vírus MON-1, MON-24, MON-34, MON-72, MON-77, MON-80, MON-98, MON-105, MON-108, MON-199 e MON. -199 Variante NP1130 e MON-281. Em particular, o MON-1 é o zimodema mais frequente em humanos e cães [3, 4], seguido pelo MON-72, que é mais difuso no CanL, mas que também foi identificado em pacientes humanos [5]. Em contraste, alguns zimodemas (ou seja, MON-11, MON-27, MON-28, MON-29, MON-33, MON-189) foram isolados apenas em humanos [6]. Além disso, vários parasitas não MON-1 foram relatados em pacientes com HIV [7]. Estas descobertas colocam em causa o papel dos cães, historicamente considerados o principal reservatório de infecção para os seres humanos, na transmissão da doença. Na verdade, a homogeneidade dos zimodemas identificados na população canina não reflete a heterogeneidade daqueles encontrados em humanos.