Uma nova estratégia para rastrear mutações na voltagem

Doenças Infecciosas da Pobreza volume 12, Número do artigo: 74 (2023) Citar este artigo

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A actual estratégia de prevenção e controlo do Aedes albopictus depende fortemente de uma gestão abrangente, como a gestão ambiental e o controlo químico. No entanto, a ampla aplicação de piretróides facilitou o desenvolvimento de resistência a inseticidas, principalmente através de mutações no gene do canal de sódio dependente de voltagem (VGSC). Este estudo tem como objetivo desenvolver uma nova estratégia para detecção de mutações no gene VGSC em Ae. albopictus usando tecnologia de minisequenciamento de espectrometria de massa por PCR multiplex (MPCR-MS).

Estabelecemos uma nova estratégia para detecção de mutações no gene VGSC em Ae. albopictus usando tecnologia de minisequenciamento MPCR-MS. A amplificação MPCR e a extensão de sonda de massa (MPE) foram utilizadas pela primeira vez, seguidas de espectrometria de massa com tipagem de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), que permite a detecção simultânea de múltiplos sítios de mutação do gene VGSC em 96 amostras de Ae. albopictus. Um total de 70 Ae. albopictus foram utilizados para avaliar o desempenho do método comparando-o com outros métodos.

Três locais alvo (1016, 1532, 1534) no gene VGSC podem ser detectados simultaneamente por dupla amplificação por PCR combinada com espectrometria de massa por ionização por dessorção a laser assistida por matriz e tempo de voo, atingindo um limite de detecção de 20 fg / μl. Aplicamos este método a 70 Ae coletados na natureza. albopictus, e os genótipos obtidos foram consistentes com os resultados do sequenciamento de rotina, sugerindo a precisão do nosso método.

A tecnologia de minisequenciamento MPCR-MS fornece uma abordagem sensível e de alto rendimento para Ae. triagem de mutação do gene VGSC albopictus. Comparado com o sequenciamento convencional, este método é econômico e economiza tempo. É de grande valor para a vigilância da resistência aos insecticidas em áreas com elevado risco de doenças transmitidas por vectores.

O Aedes albopictus é um importante vetor de transmissão de arbovírus, incluindo o vírus da dengue, o vírus da chikungunya e o vírus Zika [1,2,3]. Como uma das espécies de mosquitos mais invasivas, com reprodução rápida e comportamento agressivo [4, 5], Ae. albopictus expandiu com sucesso sua presença em mais de 70 países em todo o mundo [6]. Atualmente, Ae. albopictus é controlado por uma combinação de métodos biológicos, químicos e físicos, e inseticidas químicos são usados ​​​​principalmente para matar mosquitos diretamente [7, 8]. Destes inseticidas, os piretróides são os mais amplamente utilizados devido ao seu amplo espectro, alta eficiência e baixa toxicidade para mamíferos [9, 10].

Canais de sódio dependentes de voltagem, codificados pelo gene VGSC, são o principal alvo dos inseticidas piretróides. Mutações no gene VGSC poderiam reduzir a suscetibilidade do Ae. albopictus aos piretróides, resultando em resistência ao knockdown [11]. A primeira mutação de sentido (F1534C) foi descoberta em Cingapura em 2011 [12]. A sequência dos loci do gene VGSC em Ae. albopictus é determinado com base na numeração dos canais de sódio em Musca domestica [13]. Vários locais de mutação foram encontrados no gene VGSC em Ae. Albopictus [14,15,16,17,18,19,20], e três deles (1016, 1532 e 1534) foram confirmados como associados à resistência ao knockdown [11]. A mutação de GTA para GGA no local do códon 1016 resulta em uma alteração de aminoácidos de valina (V) para glicina (G) [21]. No locus 1532, ATC (isoleucina, I) pode sofrer mutação para ATA (isoleucina, I) ou ACC (treonina, T) [14]. No locus 1534, o TTC de tipo selvagem (fenilalanina, F) pode ser mutado como sinônimo para TTT (fenilalanina, F) ou mutado de forma não-sinônima para TCC/TCG (serina, S), TGC (cisteína, C), TTG/CTG/CTC /TTA (leucina, L), CGC (arginina, R) ou TGG (triptofano, W) [12, 16, 18,19,20].

Atualmente, a detecção de mutações no gene VGSC em Ae. albopictus depende de sequenciamento de DNA ou PCR específico de alelo (AS-PCR). O sequenciamento de DNA é o mais amplamente utilizado e considerado o padrão ouro para detecção de mutações no VGSC. No entanto, a tecnologia de sequenciamento de DNA não é adequada para estudos com um número substancial de amostras devido ao seu alto custo e requisitos de tempo [19]. AS-PCR [19] também tem sido usado para detectar mutações em VGSC em Ae. albopictus, mas é adequado apenas para detecção em um único local, com especificidade relativamente baixa. Portanto, um método de detecção rápido, preciso, econômico e multissítio para mutações de VGSC em Ae. albopictus é uma necessidade urgente.